Kernspeckle-spezifisches hnRNP D

Molekulare Neurodegeneration Band 16, Artikelnummer: 66 (2021) Diesen Artikel zitieren

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Fehlerhaftes alternatives Spleißen spielt eine entscheidende Rolle bei Alterung und altersbedingten Krankheiten. Berichten zufolge regulieren heterogene nukleare Ribonukleoproteine ​​(hnRNPs) den RNA-Spleißprozess. Ob und wie hnRNPs zu altersbedingten neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere der Alzheimer-Krankheit (AD), beitragen, bleibt unklar.

Immunblotting und Immunfärbung wurden durchgeführt, um Expressionsmuster und die zelluläre/subzelluläre Lokalisierung der langen Isoform von hnRNP D-like (L-DL), einem Mitglied der hnRNP-Familie, im Hippocampus der Maus zu bestimmen. Die Herunterregulierung von L-DL in WT-Mäusen wurde durch AAV-vermittelte shRNA-Abgabe und anschließende gedächtnisbezogene Verhaltenstests erreicht. Das L-DL-Interaktom wurde mittels Affinitätspräzipitation und Massenspektrometrie analysiert. Alternatives RNA-Spleißen wurde mittels RNA-seq gemessen und mit bioinformatikbasierten Ansätzen analysiert. Die Herunter- und Hochregulierung von L-DL in APP/PS1-Mäusen wurde mittels AAV-vermittelter Transduktion durchgeführt.

Wir zeigen, dass L-DL spezifisch in Kernflecken lokalisiert ist. Die L-DL-Spiegel sind im Hippocampus älterer Mäusegehirne verringert und eine Herunterregulierung von L-DL beeinträchtigt die Wahrnehmung bei Mäusen. L-DL dient als Strukturkomponente zur Rekrutierung anderer Speckle-Proteine ​​und reguliert die Zytoskelett- und Synapsen-bezogene Genexpression durch Veränderung des RNA-Spleißens. Mechanistisch gesehen werden diese Spleißänderungen durch die L-DL-vermittelte Interaktion von SF3B3, einer Kernkomponente von U2-snRNP, und U2AF65, einem U2-Spleißosomenprotein, das die Bindung von U2-snRNP an RNA steuert, moduliert. Darüber hinaus sind die L-DL-Spiegel im Gehirn von APP/PS1-Mäusen verringert. Während eine Herunterregulierung von L-DL Gedächtnisdefizite verschlechtert und eine Überexpression von L-DL die kognitive Funktion bei AD-Mäusen verbessert, indem sie das alternative Spleißen und die Expression des synaptischen Gens CAMKV reguliert.

Unsere Ergebnisse definieren einen molekularen Mechanismus, durch den hnRNP-L-DL das alternative RNA-Spleißen reguliert, und belegen eine direkte Rolle von L-DL bei AD-bedingter synaptischer Dysfunktion und Gedächtnisverlust.

Alternatives Spleißen ist ein Prozess, bei dem bestimmte Regulatoren die Kernspleißmaschinerie modulieren, um selektiv verschiedene Spleißvarianten zu erzeugen [1]. Das Prä-mRNA-Spleißen beruht auf der Rekrutierung eines großen Ribonukleoproteinkomplexes, bekannt als Spleißosom, an 5′- und 3′-Spleißstellen (5′SS und 3′SS). Typischerweise wird das 3'SS durch U2-Hilfsfaktoren (U2AFs) beim Zusammenbau von Spleißosomen gebunden, wobei die kleine U2AF-Untereinheit U2AF35 an das 3'-SS bindet und die große Untereinheit U2AF65 an den Polypyrimidintrakt neben dem 3'-SS bindet [2] . U2AF65 interagiert mit dem Spleißfaktor 3B (SF3B) der Kern-U2-Komponente des kleinen nuklearen Ribonukleoproteins (U2 snRNP) wie SF3B1, SF3B2 oder SF3B3, um die Bindung von U2 snRNP an Verzweigungsstellen und die anschließende Bildung und Aktivierung des Spleißkomplexes und schließlich die Entfernung von Introns zu fördern [3 ].

Die Alterung des Gehirns ist ein irreversibler physiologischer Prozess, der mit einer verminderten kognitiven Funktion und Gedächtnisverlust einhergeht [4]. Alter ist ein wesentlicher Risikofaktor für das Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen [5, 6]. Es gibt immer mehr Beweise dafür, dass sich das alternative Spleißen im Zuge der Gehirnalterung und altersbedingter neurodegenerativer Erkrankungen weltweit verändert [7]. Darüber hinaus führt fehlerhaftes Spleißen zu unregelmäßigen Spleißprodukten mit fehlerhaften oder sogar schädlichen Funktionen und trägt zur Alterung oder altersbedingten Krankheiten bei [8]. Beispielsweise führt das Überspringen des postsynaptischen Dichteproteins 95 (PSD95) im Exon 18 zur Erzeugung einer Spleißvariante mit vorzeitiger Translationsterminierung, und diese Spleißvariante ist anfällig für einen Abbau über den NMD-Weg (Nonsense-Mediated Decay), was zu verringerten PSD95-Spiegeln führt [9]. Diese Spleißveränderung von PSD95 wird durch das Polypyrimidin-Trakt-Bindungsprotein 1 (PTBP1) gefördert, dessen Spiegel mit fortschreitendem Alter deutlich ansteigen [10]. Diese Ergebnisse legen nahe, dass altersabhängiges, durch RNA-Bindungsproteine ​​vermitteltes alternatives Spleißen für Veränderungen in der synaptischen Struktur und Funktion während des Alterungsprozesses verantwortlich ist. BACE1, das für die β-Sekretase 1 kodiert, die das Amyloid-Vorläuferprotein in β-Amyloid (Aβ) katalysiert, unterliegt beim Altern einem umfassenden alternativen Spleißen [11, 12]. Infolgedessen zeigt BACE1 in voller Länge einen altersabhängigen Anstieg, was zu einem Anstieg des BACE1-Spiegels und einer daraus resultierenden Akkumulation von Aβ im Gehirn führt [13]. Dies führt zu einer altersbedingten kognitiven Beeinträchtigung und einem Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit [14–16]. Bemerkenswerterweise führt eine Mutation im Intron 4 von Presenilin 1 (PS1) zur Produktion eines abweichenden Transkripts und eines PS1 voller Länge mit der Insertion eines zusätzlichen Threonins, was folglich die Aβ42-Produktion und die AD-Pathologie fördert [17, 18].

Kernflecken, auch bekannt als SC35-Domäne, wurden ursprünglich als Speicherort für RNA-Prozessierungsfaktoren entdeckt, deren Funktionen überwiegend mit dem alternativen Spleißen von Prä-mRNA verbunden sind [19]. Form und Größe von Kern-Speckles unterliegen aufgrund des kontinuierlichen Austauschs von Spleißfaktoren zwischen Speckles und Nukleoplasma einem dynamischen Wandel [20]. Zelluläre Prozesse wie Pol-II-Transkription und -Spleißen sind an dynamischen Veränderungen von Kernflecken beteiligt [21]. Heterogene nukleare Ribonukleoproteine ​​(hnRNPs), ein klassischer Spleißregulator, sind maßgeblich an der alternativen Spleißregulation beteiligt [1]. Biochemische Reinigung und proteomische Analysen haben das Vorhandensein mehrerer hnRNPs in Kernflecken identifiziert, die zur Aufrechterhaltung der strukturellen und funktionellen Integrität von Kernflecken beitragen können [22, 23].

Hier zeigen wir, dass L-DL überwiegend in Neuronen exprimiert wird und seine Spiegel im Hippocampus sowohl bei älteren als auch bei AD-Gehirnen deutlich verringert sind. Insbesondere ein Mangel an L-DL im Hippocampus beeinträchtigt die kognitive Funktion. Wir entdecken, dass L-DL speziell in Kernflecken lokalisiert ist und als Strukturkomponente zur Aufrechterhaltung der Struktur dieses Kernkörpers dient. Darüber hinaus reguliert L-DL die Spleißmuster mehrerer Zytoskelett- und Synapsen-bezogener Gene, indem es die Beladung der Prä-mRNAs mit U2-snRNP-vermittelten Spleißosomen moduliert. Darüber hinaus sind die L-DL-Spiegel im Gehirn von APP/PS1-Mäusen (AD-Modell) verringert, und eine weitere Herunterregulierung von L-DL bei diesen Mäusen verschlechtert den Gedächtnisverlust, wohingegen eine Überexpression von L-DL bei AD-Mäusen die synaptische Proteinexpression und die kognitive Funktion wiederherstellt . Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass nuklearer Speckle-spezifisches L-DL alters- und AD-bedingte kognitive Funktionen reguliert, indem es das alternative Spleißen von Zytoskelett- und Synapsen-bezogenen Genen moduliert.

Neuro-2a-Zellen (N2a) (ATCC, CCL-131) und 293T-Zellen (ATCC, CRL-3216) wurden gemäß Standardverfahren kultiviert. Die Zellen wuchsen in DMEM (Gibco, Nr. 12100061), ergänzt mit 10 % FBS (Biological Industries, Nr. 1827594) und 1 % Penicillin/Streptomycin (Gibco, Nr. 15070063) und inkubiert in einem 5 % befeuchteten CO2-Inkubator bei 37 °C. Die Plasmidtransfektion wurde unter Verwendung von PEI (Sigma-Aldrich, Nr. 408727) durchgeführt, wenn die Zellen zu etwa 70–80 % konfluent waren.

C57BL/6 J-Mäuse wurden von GemPharmatech und APP/PS1-Mäuse vom Shanghai Model Organisms Center gekauft. Alle Versuchsprotokolle wurden vom Animal Studies Committee der University of Science and Technology, Hefei, China, genehmigt.

Um den pcDNA 3.1 (+)-GST-Vektor zu erzeugen, wurde die GST-Sequenz aus pcDNA3.1 + N-GST (TEV) (GenScript) PCR-amplifiziert und in Nhe I/EcoR I-Restriktionsstellen von pcDNA 3.1 (+) (Thermo Fisher Scientific) subkloniert , #V790–20). Um das pcDNA 3.1 (+)-GST-L-DL-Plasmid zu erzeugen, wurde die kodierende Sequenz von L-DL aus cDNA, die aus dem Hippocampus der Maus stammt, PCR-amplifiziert und dann in EcoR I/Xho I-Restriktionsstellen von pcDNA 3.1 (+)-GST subkloniert Vektor. Primer zum Klonen sind in Tabelle S1 aufgeführt.

Der Spleißreporter wurde gemäß zuvor veröffentlichten [24] konstruiert. Luciferase-Intron-Mutante (Luciferase-Mut), die durch Einfügen eines Immunglobulin-Introns (Promega, #U47119) in das Firefly-Luciferase-Gen erzeugt wurde, und Wildtyp-Firefly-Luciferase (Luciferase-WT) mit PEST- und CL1-Sequenz zur Proteindestabilisierung synthetisiert (Tsingke) und in BamH I/EcoR I-Restriktionsstellen des pcDNA 3.1 (+)-Vektors subkloniert.

Für das Adeno-assoziierte Virus (AAV)-Plasmid, das L-DL-shRNA exprimiert, wurden vier vom H1-Promotor gesteuerte L-DL-shRNA-Sequenzen tandemartig angeordnet und synthetisiert (Tsingke) und dann in BamH I/EcoR I-Restriktionsstellen von pAAV-EF1a-DIO subkloniert. Gcamp6s-Vektoren (Addgene, Nr. 67526), ​​wobei der EF1a-Promotor durch den CamkIIα-Promotor ersetzt wurde, gefolgt von einer zsGreen-Sequenz zur neuronenspezifischen Visualisierung der injizierten Bereiche. AAV wurde hergestellt und zum Abbau mikroinjiziert in den Hippocampus von Mausgehirnen. Die Sequenzen von Luciferase-WT, Luciferase-Mut und vier tandemartig angeordneten L-DL-shRNA-Sequenzen sind in Tabelle S2 aufgeführt.

L-DL-sgRNAs wurden mit Online-sgRNA-Designtools entworfen: https://sg.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_SEQUENCE. Vier Maus-sgRNAs und vier menschliche sgRNAs wurden wie zuvor beschrieben separat in die BsmB I-Stelle des LentiCRISPR v2-Plasmids (Addgene, Nr. 52961) subkloniert (25, 26). Diese sgRNA-Sequenzen sind in Tabelle S3 aufgeführt.

Eine Mischung aus vier L-DL-sgRNAs auf dem lentiCRISPR-Plasmid wurde zusammen mit dem Verpackungsplasmid (pHR'8.2deltaR) und dem Hüllplasmid (pCMV-VSV-G) in 293T-Zellen co-transfiziert. Virushaltiges Medium wurde 48 Stunden nach der Transfektion geerntet. Die Zellen wurden 48 Stunden lang mit virushaltigem Medium behandelt. Transduzierte Zellen wurden mit 10 μg/ml Puromycin selektiert.

Zellen und Gehirngewebe wurden in PBS plus 1 % Trion Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Nr. 23250) gemessen und die gleiche Proteinmenge wurde durch SDS-PAGE-Elektrophorese aufgetrennt. Anschließend wurden die Proteine ​​vom Gel auf eine 0,45 μm Nitrozellulosemembran (Pall Corporation, Nr. 27182369) übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % fettfreier Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,1 % Tween 20 (TBST) enthielt, 1 Stunde lang blockiert, gefolgt von einer Inkubation mit primären Antikörpern bei 4 °C über Nacht. Die folgenden Primärantikörper wurden verwendet: Kaninchen-Anti-L-DL (Sigma-Aldrich, #HPA063147) in einer Verdünnung von 1:2.000, Kaninchen-Anti-hnRNP DL (Abcepta, #AP5352c) in einer Verdünnung von 1:1.000, Maus-Anti-GST (Santa Cruz Biotechnology, #sc-138) bei einer Verdünnung von 1:5.000, Maus-Anti-RBM25 (Santa Cruz Biotechnology, #sc-374271) bei einer Verdünnung von 1:500, Maus-Anti-NPM1 (Proteintech, #60096-1-Ig ) bei einer Verdünnung von 1:2.000, Maus-Anti-PML (Abcam, #ab6263) bei einer Verdünnung von 1:1.000, Maus-Anti-SF3B1 (Santa Cruz Biotechnology, #sc-514655) bei einer Verdünnung von 1:1.000, Maus-Anti- U2AF65 (Santa Cruz Biotechnology, Nr. sc-53942) bei einer Verdünnung von 1:1.000, Maus-Anti-U2AF35 (Proteintech, Nr. 60289-1-Ig) bei einer Verdünnung von 1:2.500, Kaninchen-Anti-SF3B3 (Proteintech, Nr. 14577-1). -AP) bei einer Verdünnung von 1:2.000, Kaninchen-Anti-PSD95 (Proteintech, #20665-1-AP) bei einer Verdünnung von 1:1.000, Kaninchen-Anti-SNAP25 (Proteintech, #14903-–1-AP) bei einer Verdünnung von 1: 5.000, Kaninchen-Anti-CAMKV (Proteintech, #14788-1-AP) bei einer Verdünnung von 1:1.000, Kaninchen-Anti-NR2B (Proteintech, #21920-1-AP) bei einer Verdünnung von 1:2.000, Kaninchen-Anti-SC35 (Abclonal , #A3635) bei einer Verdünnung von 1:1.000000, Maus-Anti-Lamin B1 (Proteintech, #66095-1-Ig) bei einer Verdünnung von 1:5.000, Maus-Anti-GAPDH (Proteintech, #60004-1-Ig) bei einer Verdünnung von 1:5.000, Kaninchen-Anti-Lamin A/C (Proteintech, #10298-1-AP) bei einer Verdünnung von 1:5.000. Ziege-Anti-Maus-IgG (H + L) (Peroxidase/HRP-konjugiert) (Elabscience, #E-AB-1001) oder Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (H + L) (Peroxidase/HRP-konjugiert) (Elabscience, #E-AB -1003) Sekundärantikörper wurden in einer Verdünnung von 1:5.000 verwendet. Die immunreaktiven Banden wurden mit Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific, Nr. 32209) nachgewiesen. Für densitometrische Analysen wurden immunreaktive Banden mithilfe der Fidschi-Software (https://imagej.nih.gov/ij/) quantifiziert.

Auf Deckgläser ausgesäte Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und anschließend 20 Minuten lang in 4 % PFA fixiert. Die Zellen wurden mit PBS, das 0,4 % Triton X-100 (PBST) enthielt, permeabilisiert, gefolgt von einer 30-minütigen Blockierung mit 2 % BSA in PBST. Nach der Blockierung wurden die Zellen mit Kaninchen-Anti-L-DL (Sigma-Aldrich, #HPA063147) in einer Verdünnung von 1:200, Maus-Anti-SC35 (BD Bioscience, #556363) in einer Verdünnung von 1:200, Maus-Anti- SON (Santa Cruz Biotechnology, #sc-398508) bei einer Verdünnung von 1:200, Maus-Anti-RBM25 (Santa Cruz Biotechnology, #sc-374271) bei einer Verdünnung von 1:50, Maus-Anti-NPM1 (Proteintech, #60096-1). -Ig) bei einer Verdünnung von 1:200, Maus-Anti-PML (Abcam, #ab6263) bei einer Verdünnung von 1:50, Maus-Anti-SMN (Abcam, #ab5831) bei einer Verdünnung von 1:50 über Nacht bei 4 °C, gefolgt durch Inkubation mit Alexa Fluor 594-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Thermo Fisher Scientific, Nr. R37117) oder Alexa Fluor 488-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper (Thermo Fisher Scientific, Nr. R37120) und 4′, 6- Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI) (Sigma-Aldrich, #D9542).

Die Immunfärbung von Gehirngewebe wurde wie zuvor beschrieben mit Modifikationen durchgeführt (27). Die Mäuse wurden anästhesiert und getötet, dann mit 0,9 %iger NaCl-Lösung perfundiert. Die Gehirne wurden isoliert, in 4 % Paraformaldehyd (PFA) getaucht und in 30 % Saccharose für 24 Stunden bei 4 °C kryokonserviert. Anschließend wurden die Gewebe in die OCT-Verbindung eingebettet und mit einem Mikrotom in einer Dicke von 10 μm geschnitten (Leica, CM1860). Auf Glasobjektträgern montierte Schnitte wurden mit TBS (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,2) gewaschen, mit TBS mit 0,25 % Triton X-100 permeabilisiert und anschließend mit 0,5 % BSA in TBST-Puffer (20 mM Tris, 150 mM) blockiert NaCl, 0,1 % Triton X-100, pH 7,2) für 1 Stunde. Die Schnitte wurden dann mit Kaninchen-Anti-L-DL (Sigma-Aldrich) in einer Verdünnung von 1:400, Maus-Anti-GFAP (BD Bioscience, #556328) in einer Verdünnung von 1:100, Maus-Anti-NeuN (Millipore, #) inkubiert. MAB377) bei einer Verdünnung von 1:100 bei 4 °C über Nacht. Nach dem Waschen wurden die Schnitte mit Alexa Fluor 594-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Thermo Fisher Scientific) oder Alexa Fluor 488-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper (Thermo Fisher Scientific) inkubiert. Fluoreszenzsignale wurden mit einem konfokalen Leica TCSSPE-Mikroskop erfasst und mit der Fiji-Software analysiert.

293T-Zellen wurden mit GST-Kontroll- (GST-CTRL) oder GST-L-DL-Plasmiden transfiziert und Zelllysate wurden mit GST-Bindungspuffer (PBS-Puffer mit 0,1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100 und 1 % Proteinase-Inhibitor-Cocktails) gesammelt , pH 7,4). Anschließend wurden die Zellen mit Ultraschall behandelt, bis das Lysat klar und transparent war. Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Nr. 23225) gemessen und 500 μg Zelllysate wurden zur Inkubation mit 30 μl GST-Agarosekügelchen (Cytiva, Nr. 17075601) über Nacht bei 4 °C verwendet. Die Perlen wurden dreimal mit Puffer A (PBS-Puffer mit 0,1 % SDS und 0,3 % Desoxycholat und 0,3 % NP-40, pH 7,4) und Puffer B (50 mM Tris-HCl mit 10 mM MgCl2 und 0,5 % NP-40, pH) gewaschen 7.4). GST-bindende Proteine ​​wurden mit Proteinladepuffer (10 mM Tris-HCl mit 0,4 % SDS und 20 mM DTT und 2 % Glycerin und 0,05 % Bromphenolblau-Farbstoff, pH 6,8) eluiert. Die Perlen wurden durch 1-minütige Zentrifugation bei 5.000 U/min entfernt. Der Überstand wurde für den Western-Blot- oder Silberfärbungstest gesammelt.

Die Silberfärbung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [28]. Kurz gesagt, die Gele wurden 2 Stunden lang in Fixierlösung (50 % Ethanol, 12 % Essigsäure und 0,05 % Formalin) getaucht und anschließend zweimal 40 Minuten lang mit 20 % EtOH gewaschen. 0,02 % Natriumthiosulfatlösung wurde verwendet, um das Gel 2 Minuten lang zu sensibilisieren, gefolgt von einem Waschen mit entionisiertem Wasser. Anschließend wurden die Gele 20 Minuten lang mit 0,2 % AgNO3 mit 0,076 % Formalin inkubiert und anschließend zweimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Abschließend wurden die Gele in einer 6 %igen Na2CO3-Lösung mit 0,0004 % Na2S2O3 und 0,05 % Formalin für 2–5 Minuten entwickelt und die Entwicklung in 12 %iger Essigsäure beendet. Die Zielbanden wurden einer Massenspektrometrieanalyse (MS) (PTM Biolab) unterzogen. Durch MS identifizierte Proteine ​​sind in Tabelle S4 aufgeführt. Funktionelle Anmerkungen wurden auf der Website http://metascape.org/ durchgeführt, mit Proteinbeitritt wie zuvor beschrieben [29]. Die Analyse der Anreicherung zellulärer Komponenten wurde mit einem Tool durchgeführt, das auf der Website http://geneontology.org/ verfügbar ist. Analysen zu L-DL-assoziierten Proteininteraktionen wurden in der STRING-Datenbank (https://string-db.org/) (v.11.0, H. sapiens-Datensatz, PPI-Anreicherung P-Wert: < 1,0e-16) durchgeführt zu zuvor veröffentlichten [30].

Der Spleiß-Reporter-Assay wurde gemäß den zuvor beschriebenen Verfahren durchgeführt (24). Kurz gesagt, L-DL-KO- und Kontroll-N2a-Zellen (CTRL) wurden 12 Stunden lang mit Luciferase-WT oder Luciferase-Mut transfiziert. Die relative Luciferase-Aktivität wurde anhand der folgenden Formel berechnet:

Die Gesamt-RNA wurde mit TRIzol-Reagenz (Invitrogen, Nr. 15596026) gemäß dem Protokoll des Herstellers aus Zellen oder Geweben extrahiert. RNA wurde unter Verwendung des HiScriptIII 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme, #R312) revers in cDNA transkribiert. Für die Spleißanalyse wurden spezifische Primer verwendet, um Genspleißisoformen unter Verwendung von Easy Taq DNA Polymerase (Transgen, #AP111) zu amplifizieren. Die PCR-Produkte wurden mit einem 3 %igen Agarose-FSME-Gel analysiert. Die Qualifizierung der PCR-Produkte wurde von Fiji Software durchgeführt. Spezifische Spleißprimer sind in Tabelle S5 aufgeführt.

Für die RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) wurde Gesamt-RNA aus Zellen isoliert und mRNA mit Oligo (dT)-Beads angereichert, gefolgt von Fragmentierung und reverser Transkription mit Zufallsprimern. Die erhaltenen cDNAs wurden gereinigt, ihre 5'- und 3'-Enden repariert und mit Adaptern ligiert. Ligierte cDNAs wurden durch PCR amplifiziert und dem Illumina Novaseq-System zur 150-nt-Paar-End-Sequenzierung (Annoroad) unterzogen. Die Lesevorgänge wurden auf das Mausgenom ausgerichtet (Mus_musculus.GRCm38.90.chr). Für die alternative Spleißanalyse wurden „Percent Spliced ​​In“-Werte (PSI) verwendet, die mit der Software rMATS (v4.1.0) berechnet wurden, um alternative Spleißniveaus von Exon-Skipping, Intron-Retention, sich gegenseitig ausschließenden Exon-Einschlüssen und alternativen 5‘-Spleißstellen zu definieren. und alternative 3′-Spleißstellen, wie bereits berichtet [31]. Die positive Änderung von ΔPSI (PSIL-DL KD-PSICTRL > 0) stellt eine Zunahme des Einschlusses dar, und die negative Änderung von ΔPSI (PSIL-DL KD-PSICTRL < 0) stellt eine Abnahme des Einschlusses dar.

Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) wurde nach zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt (32, 33). Kurz gesagt, AAV-Plasmid mit Zielsequenzen, pHelper und Helfer-2/9-Plasmid wurden in einem Verhältnis von 2:1:1 durch PEI in 293T-Zellen co-transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium durch DMEM plus 2 % FBS ersetzt. Sowohl die Zellen als auch das Medium wurden 72 Stunden nach der Transfektion zur AAV-Reinigung gesammelt.

AAV-Partikel wurden durch Einfrier-/Auftauzyklen aus den Zellen freigesetzt, gefolgt von einer 30-minütigen Behandlung mit 50 U/ml Benzonase-Nuklease (MKbio) und 10 U/ml RNase I (Vazyme) bei 37 °C und einer anschließenden Inkubation für weitere 30 Minuten Zugabe von 0,5 % Natriumdesoxycholat (Sigma-Aldrich). Zelltrümmer wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 2.500 g entfernt, 40 % PEG8000 und 2,5 M NaCl wurden zugegeben, um das Virus auszufällen. Das Viruspellet wurde in PBS resuspendiert und kontaminierte Proteine ​​wurden durch Chloroform- und (NH4)2SO4-Extraktion entfernt. Der Virustitter wurde durch einen qPCR-basierten Ansatz bestimmt.

Männliche Wildtyp-C57BL/6-J-Mäuse im Alter von 8 Wochen wurden stereotaktisch mit L-DL-shRNA (0,8 μl, 2 × 1011 TU/ml) oder Kontroll-shRNA (0,8 μl, 8 × 1011 TU/ml) Adenovirus injiziert bilaterale CA1-Bereiche des Hippocampus mit einem Luftdruckinjektorsystem (KDS). Männliche APP/PS1-Mäuse im Alter von 6 Monaten erhielten stereotaktisch L-DL-shRNA (0,8 μl, 2 × 1011 TU/ml) oder Kontroll-shRNA-Adenovirus (0,8 μl, 8 × 1011 TU/ml) mit L-DL-Überexpression (0,5 μl, 7 × 1011 TU/ml) oder Kontroll-Adenovirus (0,5 μl, 8 × 1011 TU/ml) in die bilateralen CA1-Bereiche des Hippocampus mit einem Luftdruckinjektorsystem (KDS). Die für stereotaktische Injektionen verwendeten Koordinaten waren AP -2,3, ML 2,0, DV -1,5 und AP -2,3, ML -2,0, DV − -1,5. Verhaltenstests wurden 4 Wochen nach der Injektion durchgeführt.

Zur Bewertung des räumlichen Lernens und des Gedächtnisses wurde die Morris-Wasserlabyrinth-Aufgabe gemäß einer zuvor veröffentlichten Studie durchgeführt [34]. Kurz gesagt wurde eine Plattform (10 cm) in ein schwarzes kreisförmiges Becken (Durchmesser: 120 cm) getaucht. Während der Trainingsphase erhielt jede einzelne Maus fünf Tage lang aufeinanderfolgende Versuche. Am Testtag der Sonde wurde die Plattform entfernt und die Mäuse durften 90 Sekunden lang schwimmen, beginnend an der Stelle gegenüber der Plattform. Verhaltensparameter wurden mit einer Videokamera aufgezeichnet, die oben auf dem kreisförmigen Pool angebracht war, und die Daten wurden mit der Software Ethovision XT 11 (Noldus) analysiert.

Die Aufgabe zur Erkennung neuartiger Objekte wurde wie zuvor beschrieben mit Modifikationen durchgeführt [35, 36]. Kurz gesagt, alle Mäuse wurden in eine offene Feldbox gesetzt und durften am ersten Tag 5 Minuten lang die leere offene Feldarena frei erkunden. Am zweiten Tag wurde jede Maus einer Gewöhnungsphase mit der Erkundung zweier identischer Objekte (A + A) unterzogen ) für 5 Min. 4 Stunden nach der Eingewöhnungsphase durfte die Maus das Feld mit einem vertrauten Objekt (A) und einem neuen Objekt (B) an derselben Position 5 Minuten lang erkunden. Verhaltensparameter wurden mit einer Videokamera oben auf der Arena aufgezeichnet und die Daten mit der Software Ethovision XT 11 (Noldus) analysiert. Der Diskriminierungsindex wird als Verhältnis der Zeit zum Erkunden des neuen Objekts zur gesamten Erkundungszeit für beide Objekte berechnet.

Die modifizierte Version des Y-Labyrinthtests wurde wie zuvor beschrieben mit Modifikationen an weißen Polypropylenwänden mit drei Armen (10 × 40 × 16 cm) durchgeführt (37, 38). Dieser Test umfasst einen Probephasenversuch und einen Testphasenversuch. Im Probenphasenversuch wurden Mäuse mit einem von drei Armen geschlossen in das Labyrinth gesetzt und durften sich 6 Minuten lang frei erkunden. Die Kammern wurden vor und nach jedem Gebrauch mit 70 %igem Ethanol gereinigt. 6 Stunden nach dem Probenphasenversuch durften die Mäuse im Testphasenversuch das Feld des Labyrinths mit drei geöffneten Armen 6 Minuten lang frei erkunden. Der zuvor in der Stichprobenphase geschlossene Arm wurde als neuer Arm definiert. Verhaltensparameter wurden mit einer Videokamera aufgezeichnet und die im neuen Arm verbrachte Zeit mit der Software Ethovision XT 11 (Noldus) analysiert.

Die Open-Field-Aufgabe wurde wie zuvor beschrieben in einer großen quadratischen Kammer durchgeführt [39]. Während des Tests wurden die Mäuse in einem Eckquadrat platziert, wobei der Kopf zur Ecke des Freifeldgeräts zeigte, und man ließ sie 8 Minuten lang erkunden, um ihre Erkundungsaktivitäten aufzuzeichnen. Die Kammern wurden vor und nach jedem Gebrauch mit 70 %igem Ethanol gereinigt. Verhaltensparameter wurden mit einer Videokamera aufgezeichnet und die Daten mit der Software Ethovision XT 11 (Noldus) analysiert.

Alle quantifizierten Daten stellen einen Durchschnitt von mindestens dreifachen Proben dar. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. Die statistische Signifikanz wurde durch den Student-t-Test oder die Zwei-Wege-ANOVA in GraphPad Prism 5.0 bestimmt. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen (angezeigt durch ein Sternchen in den Abbildungen), P < 0,01 (angezeigt durch zwei Sternchen in den Abbildungen), P < 0,001 (angezeigt durch drei Sternchen in den Abbildungen), ns nicht signifikant.

hnRNP DL (DL) ist ein hochkonserviertes nukleäres RNA-Bindungsprotein, das sich in der genomischen Position 4q21 befindet [40]. Zuvor wurden zwei DL-Transkripte identifiziert (41), die in lange und kurze Isoformen von DL-Proteinen übersetzt werden, nämlich L-DL und S-DL, mit Molekulargewichten von 53 kDa bzw. 38 kDa (Abb. S1a). Um ihre Expressionsmuster mit zunehmendem Alter zu untersuchen, haben wir die L-DL- und S-DL-Spiegel im Hippocampus von 3 Monate alten Mäusen (jung) und 24 Monate alten Mäusen (im Alter) untersucht. Wir fanden eine signifikante Reduktion von L-DL, jedoch nicht von S-DL, im Hippocampus gealterter Mäuse (Abb. 1a, b). Darüber hinaus wurde L-DL bevorzugt in Neuronen exprimiert und seine Expression war in Astrozyten nahezu nicht nachweisbar (Abb. 1c, d). Diese neuronale Lokalisierung von L-DL wurde auch durch Immunfärbung bestätigt (Abb. 1e). Bemerkenswerterweise war L-DL vorwiegend im Zellkern lokalisiert, wie durch subzelluläre Fraktionierung und Immunfärbung gezeigt wurde (Abb. 1f, g). Diese Ergebnisse legen nahe, dass L-DL überwiegend in neuronalen Kernen lokalisiert ist und eine altersabhängige Reduktion im Hippocampus des Mausgehirns zeigt.

L-DL zeigt eine altersabhängige Abnahme im Gehirn. a, b Spiegel von L-DL und S-DL im Hippocampus von 3 Monate und 24 Monate alten Mäusen (3 M bzw. 24 M; n = 3 pro Gruppe), bestimmt durch Immunblotting (a) und densitometrische Analysen (b). GAPDH wurde als Eingabekontrolle einbezogen. c, d Die Konzentrationen von L-DL, NeuN, einem neuronalen Marker, und GFAP, einem Astrozytenmarker, in kultivierten Neuronen und Astrozyten wurden durch Immunblotting (c) und densitometrische Analysen (n = 3) (d) bestimmt. e Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von NeuN oder GFAP (grün), L-DL (rot) und DAPI (blau) im CA1 des Hippocampus von 3 Monate alten (3 M) Mäusen. Maßstabsbalken: 10 μm. f Proteinspiegel von L-DL im Zellkern und Zytoplasma von Hippocampus-Gewebelysaten, gemessen durch Immunblotting. Als Eingangskontrollen wurden Lamin B1 und GAPDH einbezogen. g Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von L-DL (rot) und DAPI (blau) in der CA1-Region von 3 Monate alten (3 M) Mäusen. Das rechte Feld zeigte Vergrößerungen der grauen Quadrate, die in den Übersichtsbildern des linken Felds angegeben waren. Der Kern ist durch weiße Kreise gekennzeichnet. Maßstabsbalken: 25 μm. Die statistische Analyse wurde mithilfe der ANOVA oder des zweiseitigen Student-T-Tests durchgeführt. ** P < 0,01, *** P < 0,001; Fehlerbalken bezeichnen SEM

Um die Funktion von L-DL bei der Kognition zu bestimmen, führten wir als nächstes einen L-DL-Knockdown (KD) in der CA1-Region des Hippocampus von 8 Wochen alten C57BL/6 J-Wildtyp-Mäusen (WT) durch, wobei wir die AAV-verabreichte shRNA-Technologie verwendeten. Wir injizierten mehrere L-DL-shRNA-Sequenzen in den Hippocampus von WT-Mausgehirnen und die KD-Effizienz wurde durch Untersuchung der L-DL-Spiegel in den injizierten Gehirnen bewertet (Abb. 2a, b und Abb. S1b, c). Als nächstes führten wir eine Reihe von Verhaltenstests durch, um die kognitive Funktion dieser Mäuse zu beurteilen. Bei der Morris-Wasserlabyrinth-Aufgabe verbrachten Mäuse mit reduzierter L-DL-Expression im Vergleich zu Kontrollmäusen während der Trainingsphase deutlich länger damit, die verborgene Plattform zu finden (Abb. 2c). Im Sondenversuch zeigten diese Mäuse auch weniger Plattformübergänge und verbrachten weniger Zeit im Zielquadranten (Abb. 2d-f). Bei der Aufgabe zur Erkennung neuartiger Objekte verbrachten L-DL-KD-Mäuse weniger Zeit damit, die neuartigen Objekte zu erkunden (Abb. 2g). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass L-DL-KD-Mäuse ein fehlerhaftes räumliches und kontextuelles Gedächtnis aufweisen. Bemerkenswerterweise zeigten L-DL-KD- und Kontrollmäuse ähnliche spontane Bewegungsaktivität und angstähnliches Verhalten, wie durch die Freilandaufgabe angezeigt, wodurch die Auswirkung von Bewegungsaktivität und Angst auf die Anzeige des Morris-Wasserlabyrinthtests ausgeschlossen wurde (Abb. 2h). , ich). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass L-DL eng mit der kognitiven Funktion bei Mäusen verbunden ist.

Der Verlust von L-DL im Hippocampus führt bei Mäusen zu kognitiven Defiziten. a, b L-DL-Knockdown-Effizienz im Hippocampus, bestimmt durch Immunblotting (a) und densitometrische Analysen in (b). vgl. Die Morris-Wasserlabyrinth-Aufgabe. c Die Zeit der Fluchtlatenz zur versteckten Plattform wurde für jeden Tag des räumlichen Lernens aufgezeichnet (n = 15 Mäuse pro Gruppe). Die Häufigkeit des Überquerens des Zielquadranten (d) und die im Zielquadranten (e) verbrachte Zeit im Sondenversuch (n = 15 Mäuse pro Gruppe). f Die repräsentativen Fluchtwege für Kontroll- und L-DL-KD-Mäuse im Sondenversuch. g Diskriminierungsindex für den Objekterkennungstest (n = 15 Mäuse pro Gruppe). h, i Bei der Freilandaufgabe wird die in der Mitte des Abteils verbrachte Zeit (h) und die zurückgelegte Gesamtstrecke (i) für Kontroll- und L-DL-KD-Mäuse (n = 15 Mäuse pro Gruppe) ermittelt. Die statistische Analyse wurde mithilfe der ANOVA oder des zweiseitigen Student-T-Tests durchgeführt. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001; Fehlerbalken bezeichnen SEM

Um L-DL-bindende Proteine ​​zu identifizieren, führten wir als nächstes eine Affinitätspräzipitation (AP) durch, gefolgt von SDS-PAGE und Massenspektrometrie (MS) (Abb. 3a). Interessanterweise zeigten Analysen der Genontologie (GO), dass es sich bei L-DL-assoziierten Proteinen hauptsächlich um Kern-Speckle-Proteine ​​handelt (Abb. 3b). Wir untersuchten daher die subzelluläre Lokalisierung von L-DL und stellten fest, dass L-DL zusammen mit den Kernfleckenmarkern SC35, SON und RBM25 lokalisiert war, was zeigt, dass L-DL spezifisch an Kernflecken lokalisiert ist (Abb. 3c). Keine Assoziationen von L-DL mit NPM1, einem nukleolären Protein; mit Promyelozyten-Leukämie-Protein (PML), einem PML-Körpermarker; und mit SMN, einem Cajal-Körpermarker, wurden durch Immunfärbung nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass L-DL nicht in diesen Kernkörpern lokalisiert war (Abb. 3d). GST-Pulldown- und Co-AP-Assays bestätigten die Assoziation von L-DL mit den Speckle-Komponentenproteinen SC35 und RBM25 (Abb. 3e, f). Unsere Ergebnisse zeigen, dass L-DL bevorzugt in Kernflecken lokalisiert ist. Wir untersuchten auch die subzelluläre Lokalisierung anderer hnRNP-Mitglieder durch Immunfärbung und stellten fest, dass hnRNP A1, hnRNP C, hnRNP K und hnRNP U eine homogene Verteilung im Kern aufwiesen (Abb. S2a).

L-DL ist ein wesentlicher Strukturbestandteil von Kernflecken. Ein Kontroll-GST (CTRL-GST) und GST-markiertes L-DL (GST-L-DL) wurden in 293T-Zellen eingeführt, gefolgt von einem Pulldown mit GST-Agarosekügelchen. L-DL-assoziierte Proteine ​​wurden einer Silberfärbung unterzogen, die mit schwarzen Quadraten gekennzeichneten Banden wurden einer massenspektrometrischen Analyse unterzogen. b Zellkomponentenbegriffe in der Genontologie (GO)-Analyse für L-DL-assoziierte Proteine, die in der Massenspektrometrie identifiziert wurden. c Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von L-DL (rot) und SC35 (grün), L-DL (rot) und SON (grün), L-DL (rot) und RBM25 (grün) und DAPI (blau) in 293T-Zellen. Maßstabsbalken: 10 μm. d Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von L-DL (rot) und NPM1 (grün), L-DL (rot) und PML (grün), L-DL (rot) und SMN (grün) sowie DAPI (blau) in 293T-Zellen. Maßstabsbalken: 10 μm. e CTRL-GST und GST-L-DL wurden in 293T-Zellen eingeführt, gefolgt von einem Pulldown mit GST-Agarosekügelchen. L-DL-assoziierte Proteine ​​wurden einem Immunoblot mit Anti-SC35-, Anti-RBM25-, Anti-NPM1- und Anti-PML-Antikörpern unterzogen. f CTRL-GST und GST-SC35 wurden in 293T-Zellen eingeführt, gefolgt von einem Pulldown mit GST-Agarosekügelchen. SC35-assoziierte Proteine ​​wurden einem Immunblotting mit Anti-L-DL-Antikörpern unterzogen. g Links: repräsentative Immunfluoreszenzbilder von L-DL (rot), SC35 (grün) und DAPI (blau) in Kontroll- und L-DL-Knockout (KO) 293T-Zellen. Maßstabsbalken: 10 μm. Rechts: Densitometrische Analysen der SC35-Fluoreszenzdichte. h Links: repräsentative Immunfluoreszenzbilder von L-DL (rot), SON (grün) und DAPI (blau) in Kontroll- und L-DL KO 293T-Zellen. Maßstabsbalken: 10 μm. Rechts: densitometrische Analysen der SON-Fluoreszenzdichte. Die statistische Analyse wurde mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests durchgeführt. *** P < 0,001; Fehlerbalken bezeichnen SEM

Interessanterweise führte L-DL-Knockout (KO) zu Veränderungen des zellulären Expressionsmusters von SC35 und SON von dicht gepackt zu diffus verteilt, was darauf hindeutet, dass ein L-DL-Mangel zu einer Störung der nuklearen Speckle-Struktur führt (Abb. 3g, h). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass L-DL ein wesentlicher Bestandteil ist und für die Aufrechterhaltung der Integrität nuklearer Speckles wichtig ist, indem es mit anderen wichtigen Speckle-Proteinen wie SC35 und SON interagiert.

Nuclear Speckle ist stark mit RNA-Prozessierungsfaktoren angereichert und seine Funktionen hängen hauptsächlich mit dem Spleißen vor der mRNA zusammen [42]. Die nukleäre Speckle-Lokalisierung von L-DL veranlasste uns, die Funktion von L-DL beim RNA-Spleißen zu untersuchen. Als nächstes bewerteten wir die Spleißaktivität mithilfe eines Intron-haltigen Luciferase-Reporters und fanden eine signifikante Verringerung der Spleißaktivität in L-DL-depletierten N2a-Zellen (KO) [24] (Abb. 4a, b), was darauf hindeutet, dass L-DL daran beteiligt ist RNA-Spleißprozess.

Ein Mangel an L-DL führt zu alternativen Spleißveränderungen im Gehirn. ein Diagramm für den Spleißreporter zur Messung der Spleißeffizienz. b Luciferase-WT oder Luciferase-Mut wurden in Kontroll- oder L-DL-KO-N2a-Zellen eingeführt. Die Luciferase-Spiegel wurden als fache Unterschiede von L-DL KO gegenüber Kontrollen (n = 3) aufgetragen. c Anzahl signifikant veränderter alternativer Spleißereignisse im L-DL-Knockdown (KD)-Hippocampus. d Kreisdiagramm, das die Verteilung von Exon-Skipping, Intron-Retention und anderen Spleißereignissen wie alternativer 5′-Spleißstelle, alternativer 3′-Spleißstelle und sich gegenseitig ausschließendem Exon im Hippocampus von L-DL-KD-Mäusen zeigt. e Verteilung von positivem ΔPSI (PSIL-DL KD-PSICTRL > 0) und negativem ΔPSI (PSIL-DL KD-PSICTRL < 0) für insgesamt veränderte Spleißereignisse (n = 2.181), Exon-Skipping (n = 1.569), Intron-Retention ( n = 223) und andere Spleißereignisse (n = 389) (P-Wert < 0,001). f Verteilung der ΔPSI-Werte (PSIL-DL KD-PSICTRL) bei Spleißereignissen wie Exon-Skipping (n = 1.569), Intron-Retention (n = 223) und anderen Spleißereignissen (n = 389) (P-Wert < 0,001). Die Daten wurden als Median innerhalb des Bereichs angezeigt. gi-Venn-Diagramm, das die Schnittpunkte von Genen mit verändertem alternativem Spleißen, die in Gehirnen von L-DL-KD-Mäusen identifiziert wurden, und differentiell exprimierten Genen (DEGs) zwischen gealterten und WT-Mausgehirnen (g) von Genen mit verändertem alternativem Spleißen in L-DL-KD-Mäusen zeigt Gehirne und DEGs zwischen APP/PS1- und WT-Mäusen (h), von Genen mit verändertem alternativem Spleißen in Gehirnen von L-DL-KD-Mäusen und DEGs zwischen AD-Patienten und altersangepassten Kontrollen (i). Die statistische Analyse wurde mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests durchgeführt. ** P < 0,01; Fehlerbalken bezeichnen SEM

Als nächstes untersuchten wir, ob L-DL die Wahrnehmung durch Modulation des RNA-Spleißens reguliert. Hippocampusgewebe von Kontroll- und L-DL-KD-Mäusen wurden einer RNA-Sequenzierung und anschließenden Spleißanalysen unterzogen. Spleißanalysen zeigten, dass insgesamt 2.181 Spleißereignisse signifikante Spleißmusteränderungen in L-DL-KD-Gehirnen aufwiesen, wobei Exon-Skipping das dominanteste Ereignis war (71,94 %); Zu den anderen Spleißereignissen gehörten Intronretention (10,22 %), sich gegenseitig ausschließende Exon-Einschlüsse, zurückgehaltene Introns, alternative 5′-Spleißstellen und alternative 3′-Spleißstellen (17,84 %) (Abb. 4c–d). Wir verwendeten PSI-Werte (Percent Spliced ​​In), um die alternativen Spleißniveaus jedes Gensegments durch die rMATs-Software zu definieren, wie zuvor beschrieben (31). Wir fanden heraus, dass 38,93 % dieser Gensegmente einen erhöhten Einschluss (PSIL-DL KD-PSICTRL > 0, P < 0,001) und 61,07 % einen erhöhten Ausschluss (PSIL-DL KD-PSICTRL < 0, P < 0,001) in L-DL aufwiesen KD-Gehirne (Abb. 4e-f). Bemerkenswert ist, dass der Segmentausschluss in L-DL-KD-Gehirnen beim Exon-Skipping häufiger auftrat als bei der Intron-Retention und anderen Spleißereignissen. Umgekehrt trat der Segmenteinschluss bei Intronretention und anderen Spleißereignissen häufiger auf als beim Exon-Skipping in L-DL-KD-Gehirnen (Abb. 4e–f). Alle diese Ergebnisse zeigen, dass ein L-DL-Mangel zu signifikanten Veränderungen bei mehreren alternativen Spleißereignissen im Gehirn führt.

Im Gehirn älterer Mäuse (43) und AD-Modellmäusen (APP/PS1) (44, 45) wurde eine wesentliche Veränderung der Genexpression beobachtet. Um die Beziehung zwischen den zuvor identifizierten differentiell exprimierten Genen (DEGs) in Gehirnen von älteren oder jungen oder AD- oder Kontrollgehirnen und Genen mit veränderten alternativen Spleißmustern, die im Gehirn von L-DL-KD-Mäusen identifiziert wurden, zu ermitteln, führten wir als nächstes eine überlappende Analyse durch: DEGs wurden herausgezogen aus (1) RNA-seq-Daten von Gehirnen junger vs. alter Mäuse (GSE129788), (2) RNA-seq-Daten von Gehirnen von APP/PS1 vs. WT-Mäusen (GSE132177) und (3) proteomischen Daten von menschlichen AD-Gehirnen [45] . Wir fanden heraus, dass insgesamt 127 Gene (4, 9 %) Kreuzungen von Genen mit verändertem alternativen Spleißmuster in Gehirnen von L-DL-KD-Mäusen und DEGs in Gehirnen von älteren und jungen Mäusen entsprechen (Abb. 4g). Insgesamt 136 Gene (5,9 %) entsprechen Kreuzungen von Genen mit verändertem alternativen Spleißmuster in Gehirnen von L-DL-KD-Mäusen und DEGs in Gehirnen von AD- und WT-Mäusen (Abb. 4h). Wichtig ist, dass wir insgesamt 404 Gene (9 %) entdeckt haben, die Kreuzungen von Genen mit verändertem alternativen Spleißmuster in Gehirnen von L-DL-KD-Mäusen und DEGs in AD-Gehirnen im Vergleich zu menschlichen Kontrollgehirnen entsprechen (Abb. 4i). Diese Ergebnisse zeigen, dass durch die Herunterregulierung von L-DL verursachte Spleißveränderungen wahrscheinlich zum Altern und altersbedingten Krankheiten beitragen.

GO-Analysen zeigten, dass in MS identifizierte L-DL-assoziierte Proteine ​​eine angereicherte funktionelle Annotation im Zusammenhang mit der RNA-Bindung und dem RNA-Spleißprozess aufwiesen (Abb. 5a, b). Die Netzwerkanalyse von L-DL-assoziierten Proteinen, die mit dem Begriff „mRNA-Spleißen über Spleißosom“ angereichert sind, zeigte, dass L-DL mit mehreren Komponenten des U2-Spleißosom-Komplexes interagiert (Abb. 5c). U2-snRNP ist eine Kernkomponente des Spleißosoms und SF3B ist eine Kernkomponente von U2-snRNP [46]. U2AF ist für den Aufbau des U2-snRNP-Bindungs- und Spleißkomplexes erforderlich [3, 47], wobei U2AF35 an die 3'-Spleißstellen und U2AF65 an den Polypyrimidintrakt von Prä-mRNAs bindet (Abb. 5d). Die Assoziation von L-DL- und U2-snRNPs wurde durch Co-AP validiert (Abb. 5e). Insbesondere wurde festgestellt, dass L-DL mit U2AF35, U2AF65 und SF3B3 assoziiert, jedoch nicht mit SF3B1 (Abb. 5e). Die Assoziation von L-DL und U2AF65 wurde durch Co-IP weiter bestätigt (Abb. 5f). Darüber hinaus sind sowohl SF3B1 als auch SF3B3 auch mit U2AF65 assoziiert (Abb. 5f). Wichtig ist, dass ein L-DL-Mangel die Assoziation von U2AF65 mit SF3B1 und SF3B3 erheblich verringerte (Abb. 5g, h). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass L-DL ein integraler und wesentlicher Bestandteil von U2-snRNP ist und der Verlust von L-DL die Beladung von U2-snRNP auf Prä-mRNAs stören kann. Bemerkenswerterweise haben wir auch mehrere hnRNPs wie hnRNP A1, hnRNP C, hnRNP U und hnRNP K als L-DL-assoziierte Proteine ​​bei MS identifiziert (Abb. 5c). Angesichts der Tatsache, dass diese identifizierten hnRNPs Berichten zufolge am RNA-Spleißprozess beteiligt sind (48), führten wir als nächstes Co-AP durch, um die Assoziation von L-DL und diesen hnRNPs zu validieren. Wir fanden heraus, dass L-DL tatsächlich mit hnRNP A1, hnRNP C, hnRNP U und hnRNP K assoziiert war, was die Beteiligung von L-DL am RNA-Spleißprozess weiter unterstützt (Abb. S2b).

Ein L-DL-Mangel beeinträchtigt das U2-Spleißosom-abhängige RNA-Spleißen. (ab) Begriffe der molekularen Funktion (a) und des biologischen Prozesses (b) in der GO-Analyse für L-DL-assoziierte Proteine, die in der Massenspektrometrie identifiziert wurden. c Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) für L-DL-assoziierte Proteine ​​(PPI-Anreicherung P < 1,0E-16). Das Netzwerk-Clustering basiert auf dem K-Mean-Clustering und jeder Cluster ist mit einer bestimmten Farbe gekennzeichnet. d Eine Zeichnung der U2-Spleißosomenanordnung auf Prä-mRNAs. 5′SS oder 3′SS geben 5′- bzw. 3′-Spleißstellen an. e CTRL-GST oder GST-L-DL wurden in 293T-Zellen eingeführt, gefolgt von einem Pulldown mit GST-Agarosekügelchen. L-DL-assoziierte Proteine ​​wurden durch Immunblotting bestimmt. f GST-L-DL wurde in 293T-Zellen eingeführt, gefolgt von einer Immunpräzipitation mit Anti-U2AF65-Antikörper. Die Konzentrationen an U2AF65-assoziierten Proteinen wurden durch Immunblotting gemessen. g, h Kontroll- oder L-DL-KO-N2a-Zelllysate wurden einer Immunpräzipitation mit Anti-U2AF65-Antikörper unterzogen. Die Konzentrationen von U2AF65-assoziierten Proteinen wurden durch Immunblotting (g) und densitometrische Analysen (n = 3) (h) gemessen. Die statistische Analyse wurde mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests durchgeführt. * P < 0,05, ** *** P < 0,001; Fehlerbalken bezeichnen SEM

Angesichts der Tatsache, dass ein Verlust von L-DL bei WT-Mäusen zu einem kognitiven Rückgang führt (Abb. 2c-g), postulierten wir, dass L-DL die kognitive Funktion durch Modulation des alternativen Spleißens und der Expression von Genen reguliert, die an der synaptischen Funktion beteiligt sind. Tatsächlich zeigten KEGG-Signalweg- und GO-Analysen signifikante Veränderungen beim alternativen Spleißen von Genen, die eng mit der synaptischen Funktion und dem kognitiven Prozess zusammenhängen (Abb. S3a-c). Darüber hinaus zeigten Zellkomponentenanalysen signifikante Veränderungen beim alternativen Spleißen von Genen im Zusammenhang mit mehreren Zellstrukturen neuronaler Zellen, einschließlich postsynaptischer Dichte, Synapse, Zytoskelett und dendritischer Wirbelsäule (Abb. 6a). Einige gut definierte genkodierte Produkte und ihre zelluläre Lokalisierung sind in Abb. 6b dargestellt, z. B. Dendriten- und Synapsen-bezogene Gene wie das Zelladhäsionsmolekül 1 (CADM1), ein synaptisches Zelladhäsionsmolekül, das die Synaptogenese reguliert [49]. ; G-Protein-gekoppeltes Rezeptorkinase-interagierendes Protein 2 (GIT2), das die Zytoskelettstruktur und die präsynaptische Neurotransmitterfreisetzung reguliert [50, 51]; Zelladhäsionsmolekül L1 wie (CHL1), das sich in präsynaptischen Membranen ansammelt und die synaptische Aktivität und Plastizität reguliert [52]; Calcium/Calmodulin-abhängige Serinproteinkinase (CASK), ein Synapsengerüstprotein, das an der Synapsenbildung und -funktion beteiligt ist [53]; AGRIN, ein Heparansulfat-Proteoglykan, das die Bildung erregender Synapsen fördert [54]; G-Protein-gekoppeltes Rezeptorkinase-interagierendes Protein 1 (GIT1), das den Zusammenbau von Mikrotubuli reguliert und die Bildung und Aufrechterhaltung von Synapsen fördert [55]; Src Substrate Cortactin (CTTN), das an der Aktinpolymerisation und der aktivitätsabhängigen synaptischen Plastizität beteiligt ist [56]; PSD95, ein postsynaptisches Gerüstprotein, das für die aktivitätsgesteuerte Synapsenstabilisierung erforderlich ist [57]; Adhäsions-G-Protein-gekoppelter Rezeptor L1 (ADGRL1), der an der Synapsenbildung und der Gehirnentwicklung beteiligt ist [58]. Darüber hinaus stehen einige der Gene in engem Zusammenhang mit der Bildung des Zytoskeletts oder der Mikrotubuli, z. B. Polyphosphoinositidphosphatase Synaptojanin 1 (SYNJ1), das an der Polymerisation des Aktin-Zytoskeletts und dem Recycling synaptischer Vesikel beteiligt ist (59); Erythrozytenmembranproteinbande 4.1 wie 3 (EPB41L3), die mit der Aktinbindung und Protein-Protein-Wechselwirkungen an Synapsen zusammenhängt [60, 61]; Mikrotubuli-assoziiertes Protein-Tau-Gen (MAPT), das für Tau-Protein kodiert, das am axonalen Transport, der synaptischen Plastizität und Funktion beteiligt ist [62]. Bemerkenswert ist, dass das Hippocampus-abhängige Gedächtnis eng mit der Dynamik der Mikrotubuli verbunden ist (63).

L-DL reguliert die Genexpression des Zytoskeletts und der Synapsen, indem es deren alternatives Spleißen moduliert. a Zellkomponententerme für Gene mit verändertem alternativem Spleißen im Hippocampus von L-DL-Knockdown-Mäusen (KD) in der GO-Analyse (n = 1.631, P < 0,001). b Diagramm zur zellulären Lokalisierung von Synapsen-, Dendriten- und Zytoskelett-bezogenen Proteinen, deren Gene in Neuronen einem abweichenden alternativen Spleißen unterliegen. c, d Alternative Spleißprodukte des CADM1-, GIT2-, CHL1-, CASK-, AGRIN-, GIT1-, CTTN-, PSD95-, ADGRL1-, SYNJ1-, EPB41L3- und MAPT-Gens, bestimmt durch RT-PCR im Hippocampus von Kontroll- und L-DL-KD-Mäusen (n = 3). * zeigt gespleißte Varianten an, F und R bezeichnen Primer, die für RT-PCR verwendet werden. 24 Zyklen bzw. 30 Zyklen wurden verwendet, um häufiger vorkommende bzw. weniger häufig vorkommende Spleißprodukte zu erkennen. e, f Alternative Spleißprodukte von CAMKV, bestimmt durch RT-PCR (e) und densitometrische Analysen (f) im Hippocampus von Kontroll- und L-DL-KD-Mäusen (n = 3). I4, Intron-4-Retention; ΔI4, Intron 4-Ausschluss. g, h Proteinspiegel von CAMKV, SNAP25, PSD95, NR2B im Hippocampus von Kontroll- und L-DL-KD-Mäusen, gemessen durch Immunblotting (g) und densitometrische Analysen (h). GAPDH wurde als Eingabekontrolle einbezogen. Die statistische Analyse wurde mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests durchgeführt. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001; Fehlerbalken bezeichnen das SEM

Als nächstes überprüften wir die alternativen Spleißmuster von Dendriten- und Synapsen-bezogenen Genen und beobachteten ein signifikant verringertes Überspringen von Exon 8 von CADM1, über Exon 15 von GIT2, ein signifikant erhöhtes Überspringen von Exon 24 von CHL1, über Exon 19 von CASK und über Exon 34 von AGRIN, über Exon 8 von GIT1, über Exon 11 von CTTN und über Exon 18 von PSD95 und eine signifikant erhöhte Intronretention gegenüber Intron 19 von ADGRL1 (Abb. 6c). Wir untersuchten auch die alternativen Spleißmuster von Zytoskelett-bezogenen Genen und fanden ein signifikant erhöhtes Überspringen von Exon 28 von SYNJ1, von Exon 14 von EPB41L3 und ein verringertes Überspringen von Exon 4A von MAPT (Abb. 6d). Wichtig ist, dass das Calmodulin-Kinase-ähnliche Vesikel-assoziierte (CAMKV)-Gen, dessen Mangel an CA1-Pyramidenneuronen die synaptische Plastizität und das räumliche Gedächtnis beeinträchtigt [64], einen signifikanten Anstieg der Intron-4-Retention zeigte, was zu einer verringerten Produktion von CAMKV-Protein führte (Abb. 6e). -H). Wir fanden außerdem heraus, dass die Spiegel der synaptischen Proteine ​​SNAP25, PSD95 und der NMDA-Rezeptoruntereinheit NR2B im Hippocampus von L-DL-KD-Mäusen signifikant verringert waren (Abb. 6g, h). Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass L-DL die Wahrnehmung reguliert, indem es das alternative Spleißen von Genen moduliert, die an der synaptischen Funktion beteiligt sind.

Angesichts der Tatsache, dass L-DL im Gehirn alter Mäuse verringert ist und eine Herunterregulierung von L-DL das Mausgedächtnis beeinträchtigt, untersuchten wir als nächstes die mögliche Rolle von L-DL bei altersbedingten neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere AD. Wir beobachteten zunächst eine signifikante Reduktion von L-DL im Hippocampus von APP/PS1-Mäusen (Abb. 7a, b) und führten daher eine L-DL-Überexpression (OE) oder einen L-DL-Knockdown (KD) im Hippocampus von APP/PS1-Mäusen durch. Die Überexpression von L-DL wurde durch den CamKII-Promotor gesteuert, und die L-DL-KD wurde durch die durch den H1-Promotor gesteuerte Ziel-shRNA-Expression erreicht. Die AAV-vermittelte Abgabe wurde durch Gehirninjektion in die bilateralen CA1-Bereiche des Hippocampus bei APP/PS1-Mäusen im Alter von 6 Monaten erreicht. Die L-DL-Expression wurde durch Immunblotting 4 Wochen nach der Injektion bestätigt (Abb. 7c-f). Verhaltenstests zeigten, dass L-DL OE das kontextuelle Gedächtnis bei APP/PS1-Mäusen signifikant verbesserte, was durch einen erhöhten Diskriminierungsindex bei der Erkennung neuartiger Objekte gezeigt wurde; und erhöhter Zeitaufwand im neuartigen Arm bei der Y-Labyrinth-Aufgabe im Vergleich zu Kontroll-APP/PS1-Mäusen (Abb. 7g, i). L-DL OE hatte keinen Einfluss auf die Bewegungsaktivität und Angst bei APP/PS1-Mäusen (Abb. S4a, c). Umgekehrt zeigten APP/PS1-Mäuse mit L-DL-KD im Vergleich zu Kontroll-APP/PS1-Mäusen ein verschlechtertes kontextuelles Gedächtnis, was durch einen verringerten Diskriminierungsindex bei der Erkennung neuartiger Objekte und einen geringeren Zeitaufwand im neuartigen Arm im Y-Labyrinth gezeigt wurde (Abb. 7h, J). APP/PS1-Mäuse mit L-DL-KD zeigten im Vergleich zu Kontrollmäusen keinen Unterschied in ihrer Bewegungsaktivität und Angst (Abb. S4b, d).

L-DL verbessert die kognitive Funktion bei APP/PS1-Mäusen. a, b L-DL-Spiegel im Hippocampus von 6 Monate alten APP/PS1- und altersentsprechenden WT-Mäusen, bestimmt durch Immunblotting (a) und densiometrische Analyse (n = 3) (b). c, d L-DL-Spiegel im Hippocampus von APP/PS1-Mäusen, denen zsGreen-L-DL verabreicht wurde, bestimmt durch Immunblotting (c) und densiometrische Analyse (n = 3) (d). e, f L-DL-Spiegel im Hippocampus von APP/PS1-Mäusen, die mit Kontroll- oder L-DL-shRNA behandelt wurden, bestimmt durch Immunblotting (e) und densiometrische Analyse (n = 3) (f). gj APP/PS1-Mäuse mit L-DL-Überexpression (OE) oder Knockdown (KD) wurden Verhaltenstests unterzogen. g, h Diskriminierungsindex für APP/PS1-Mäuse mit L-DL OE (g) oder L-DL KD (h) bei der Erkennung neuartiger Objekte (n = 15 Mäuse pro Gruppe). i, j Zeitaufwand im neuartigen Arm für APP/PS1-Mäuse mit L-DL OE (i) oder L-DL KD (j) im Y-Labyrinth (n = 15 Mäuse pro Gruppe). Die statistische Analyse wurde mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests durchgeführt. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001; Fehlerbalken bezeichnen SEM

Um zu untersuchen, wie L-DL OE zu einer verbesserten Kognition bei APP/PS1-Mäusen führt, untersuchten wir als Nächstes das alternative Spleißmuster von CAMKV und stellten fest, dass L-DL OE bei APP/PS1-Mäusen zu einer deutlich verringerten Intron-4-Retention und einer erhöhten Produktion von führte CAMKV-Protein (Abb. 8a, b, e, f). Darüber hinaus zeigten die synaptischen Proteine ​​SNAP25, PSD95 und NMDA-Rezeptor NR2B auch eine signifikant erhöhte Expression im L-DL OE APP/PS1-Maus-Hippocampus (Abb. 8e, f). Im Gegensatz dazu führte L-DL KD bei APP/PS1-Mäusen zu einer signifikant erhöhten Intron-4-Retention und folglich zu einer verringerten Produktion von CAMKV-Protein (Abb. 8c, d, g, h). In ähnlicher Weise waren SNAP25, PSD95 und NR2B auch im Hippocampus von APP/PS1-Mäusen mit L-DL-KD signifikant verringert (Abb. 8g, h). Insgesamt verbessert die Hochregulierung von L-DL die kognitive Funktion von AD-Mäusen durch Modulation des alternativen Spleißens und der anschließenden synaptischen Proteinproduktion.

L-DL verbessert die Kognition bei AD-Mäusen durch Modulation des alternativen Spleißens und der Expression synaptischer Gene. a, b Alternative Spleißprodukte von CAMKV, bestimmt durch RT-PCR (a) und densitometrische Analysen (b) im Hippocampus von APP/PS1-Mäusen mit Kontroll- oder L-DL-OE (n = 3 pro Gruppe). c, d Alternative Spleißprodukte von CAMKV, bestimmt durch RT-PCR (c) und densitometrische Analysen (n = 3) (d) im Hippocampus von APP/PS1-Mäusen mit Kontrolle und L-DL-KD (n = 3 pro Gruppe) . e, f Proteinspiegel von CAMKV, SNAP25, PSD95, NR2B im Hippocampus von APP/PS1-Mäusen mit Kontroll- oder L-DL-OE (n = 3 pro Gruppe), bestimmt durch Immunblotting (e) und densitometrische Analysen (f). GAPDH wurde als Eingabekontrolle einbezogen. g, h Proteinspiegel von CAMKV, SNAP25, PSD95, NR2B im Hippocampus von APP/PS1-Mäusen mit Kontroll- oder L-DL-KD (n = 3 pro Gruppe), bestimmt durch Immunblotting (g) und densitometrische Analysen (h). GAPDH wurde als Eingabekontrolle einbezogen. Die statistische Analyse wurde mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests durchgeführt. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001; Fehlerbalken bezeichnen SEM

Das alternative Spleißen von RNAs bleibt über die gesamte Lebensspanne bestehen und betrifft mehr als ein Drittel der Gene, die mit der neuronalen Funktion im menschlichen Gehirn verbunden sind [7]. Es gibt immer mehr Belege dafür, dass sich das alternative Spleißen im Laufe des Alterns und bei neurodegenerativen Erkrankungen erheblich verändert [11]. Es bleibt jedoch unklar, wie sich diese Spleißveränderungen auf die Wahrnehmung bei fortschreitendem Alter und altersbedingten neurodegenerativen Erkrankungen auswirken. Hier zeigen wir, dass L-DL die Kognition reguliert, indem es die alternativen Spleißmuster von Zytoskelett- und Synapsen-bezogenen Genen moduliert. Wir zeigen zunächst, dass die L-DL-Expression im Hippocampus von gealterten und AD-Mausgehirnen erheblich verringert ist. Wir entdecken auch, dass die KD von L-DL im Hippocampus die Kognition bei WT- und APP/PS1-Mäusen verschlechtert, wohingegen die Einführung von L-DL in den Hippocampus von APP/PS1-Mäusen die Kognition dieser Mäuse deutlich verbessert.

Kernflecken gelten als Speicherort für Spleißfaktoren und sind daher funktionell am Spleißprozess beteiligt [19]. Interessanterweise ist L-DL spezifisch an Kernflecken lokalisiert und L-DL-KD führt zu einer gestörten Kernfleckenstruktur, was darauf hindeutet, dass L-DL als Strukturkomponente dient und möglicherweise am RNA-Spleißprozess beteiligt ist. Der Prä-mRNA-Spleißprozess wird vom Spleißosom ausgeführt, einem dynamischen Protein- und RNA-Komplex in Eukaryoten [1]. Spleißosomen besitzen eine große Plastizität bei der RNA-Substraterkennung und dieser Prozess wird hauptsächlich durch RNA-Bindungsproteine ​​(RBPs) beeinflusst. hnRNPs stellen eine große Familie von RBPs dar, die maßgeblich an der Regulierung des RNA-Spleißens beteiligt sind. Beispielsweise regulieren Polypyrimidin-Trakt-Bindungsproteine ​​(PTBPs) und hnRNP K, die mit ähnlichen Bindungsmotiven an U2AF65 binden, die U2AF65-vermittelte Erkennung des U2-Spleißosoms an den 3′-Spleißstellen und beeinflussen folglich das RNA-Spleißen (65, 66). Darüber hinaus bindet hnRNP U direkt an snRNAs und reguliert die Umwandlung von 15S U2 snRNP in 17S U2 snRNP, um die U2 snRNP-Reifung und das RNA-Spleißen zu modulieren [67]. Hier zeigen wir, dass L-DL am RNA-Spleißprozess beteiligt ist, indem es die Beladung der Ziel-RNAs mit U2-snRNP-vermittelten Spleißosomen moduliert. Folglich ist die Spleißaktivität in Zellen mit L-DL-Mangel deutlich verringert.

Die regulatorische Rolle von hnRNP DL beim alternativen Spleißen von RNA wurde bereits in der Tumorentstehung nachgewiesen (68), seine Rolle im Gehirn ist jedoch noch unklar. Unsere Ergebnisse zeigen, dass L-DL in Neuronen stark exprimiert wird und seine Expression nicht nur in Gehirnen gealterter Mäuse, sondern auch in Gehirnen von AD-Mäusen deutlich reduziert ist. Zur Untermauerung dieser Schlussfolgerungen wurde festgestellt, dass die hnRNP-DL-Spiegel sowohl im menschlichen Gehirn älterer als auch AD-Menschen verringert sind [69]. Wir zeigen auch, dass im Hippocampus von L-DL-KD-Mäusen mehrere alternative Spleißänderungen auftreten. Wichtig ist, dass Exon-Skipping die dominanteste Art alternativer Spleißereignisse ist. Darüber hinaus zeigten die meisten Segmente bei Intron-Retentionsereignissen einen erhöhten Einschluss (55,61 %), was mit Spleißveränderungen übereinstimmt, über die zuvor in alternden Gehirnen berichtet wurde [7]. Veränderungen der neuronalen Plastizität stehen in engem Zusammenhang mit Veränderungen des RNA-Spleißes während des Alterns und bei altersbedingten Krankheiten [7, 13, 14]. Darüber hinaus haben frühere Studien berichtet, dass die synaptische Plastizität, die mit der Hippocampus-abhängigen Gedächtnisbildung verbunden ist, auch durch die Dynamik der Mikrotubuli reguliert wird [63]. Die GO-Termanalyse zeigte übereinstimmend, dass Gene mit Exon-Skipping im Hippocampus von L-DL-KD-Mäusen funktionell mit der Organisation des Zytoskeletts und den synaptischen Funktionen zusammenhängen.

Wichtig ist, dass die Einführung von L-DL in den Hippocampus von APP/PS1-Mäusen die kognitive Funktion deutlich verbessert. Mechanistisch zeigen wir, dass L-DL die CAMKV-Expression im Hippocampus von Mäusen reguliert, indem es das alternative Spleißen von CAMKV-Intron 4 reguliert. Um dies zu untermauern, haben frühere Berichte gezeigt, dass ein CAMKV-Mangel zu einer abnormalen Dichte der dendritischen Wirbelsäule und einer synaptischen Übertragung in kulturellen Neuronen des Hippocampus führt [64]. Darüber hinaus zeigten Hippocampus-CAMKV-Knockdown-Mäuse eine Abschwächung der Spätphasen-Langzeitpotenzierung (LTP) und Gedächtnisdefizite (64). Diese Ergebnisse unterstützen, dass L-DL den kognitiven Prozess reguliert, indem es das alternative Spleißen von CAMKV und seine Expression während der Gehirnalterung und bei neurodegenerativen Erkrankungen reguliert. Bemerkenswert ist, dass die Spiegel mehrerer synaptischer Proteine ​​im Gehirn von APP/PS1-Mäusen herunterreguliert sind [70]. Wir entdecken, dass die Einführung von L-DL die Expression mehrerer synaptischer Gene im Gehirn von AD-Mäusen fördert, darunter CAMKV, SNAP25, PSD95 und NR2B. Wir spekulieren daher, dass L-DL die Expression mehrerer Synapsen- und Zytoskelett-bezogener Gene reguliert, indem es deren RNA-Spleißprozess in AD-Gehirnen von -.CAMKV moduliert. Daher ist eine L-DL-vermittelte Verbesserung der Kognition bei APP/PS1-Mäusen wahrscheinlich darauf zurückzuführen zur Wiederherstellung der multiplen synaptischen und zytoskelettalen Genexpression über CAMKV hinaus durch Änderung der alternativen Spleißmuster dieser Gene.

Aberrante alternative Spleißveränderungen sind eng mit der Alterung des Gehirns und altersbedingten neurodegenerativen Erkrankungen verbunden. Was diese altersbedingten Spleißanomalien auslöst und welcher Regulierungsmechanismus dahinter steckt, bleibt jedoch weitgehend unklar. Hier identifizieren wir ein RNA-bindendes Protein hnRNP L-DL, dessen Expression eine alters- und AD-abhängige Reduktion im Gehirn zeigt. Bemerkenswert ist, dass L-DL bevorzugt in Kernflecken lokalisiert ist, wo L-DL das alternative Spleißen ausgewählter Synapsen- und Zytoskelett-bezogener Gene reguliert. Folglich wird diese Genexpression durch L-DL verändert. Wichtig ist, dass die Einführung von L-DL den kognitiven Rückgang bei AD-Mäusen erheblich verbessert. Zusammenfassend definiert unsere Studie das Kern-Speckle-spezifische Protein hnRNP DL als ein entscheidendes Molekül, das RNA-Spleißen und alters-/AD-bedingten kognitiven Rückgang verbindet, und wirft Licht auf einen möglichen therapeutischen Ansatz für kognitiven Rückgang bei älteren und AD-Gehirnen durch die Korrektur von fehlerhaftem RNA-Spleißen.

Die in dieser Veröffentlichung verwendeten RNA-seq-Daten wurden im Gene Expression Omnibus des NCBI hinterlegt und sind über die GEO-Serien-Zugangsnummer GSE169281 zugänglich.

Heterogene nukleare Ribonukleoproteine

Heterogenes nukleäres Ribonukleoprotein D-ähnlich

Heterogenes nukleäres Ribonukleoprotein A1

Heterogenes nukleäres Ribonukleoprotein C

Heterogenes nukleäres Ribonukleoprotein U

Heterogenes nukleäres Ribonukleoprotein K

Lange Isoform von hnRNP DL

Kurze Isoform von hnRNP DL

Spleißfaktor 3b Untereinheit 1

Spleißfaktor 3b Untereinheit 2

Spleißfaktor 3b Untereinheit 3

U2 kleines nukleares Ribonukleoprotein

U2-Hilfsfaktor-65-kDa-Untereinheit

U2-Hilfsfaktor-35-kDa-Untereinheit

5′-Spleißstellen

3′-Spleißstellen

Alzheimer-Erkrankung

Protein der postsynaptischen Dichte 95

Polypyrimidin-Trakt-bindendes Protein 1

Beta-Sekretase 1

β-Amyloid

Presenilin 1

/Spleißkomponente 35 kDa

RNA-Bindungsmotivprotein 25

Nukleophosmin 1

Promyelozyten-Leukämie-Protein

Synaptosomen-assoziiertes Protein 25

Glutamat-ionotroper Rezeptor NMDA-Typ-Untereinheit 2B

Überleben des Motoneuron-Proteins

Gliafaseriges saures Protein

Neuronales Kernprotein

Mikrotubuli-assoziiertes Protein Tau

Prozentsatz eingespleißt

Differenziell exprimierte Gene

Zelladhäsionsmolekül 1

G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase, die mit Protein 1 interagiert

G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase, die mit Protein 2 interagiert

Zelladhäsionsmolekül L1 Like

Calcium/Calmodulin-abhängige Serinproteinkinase

Cortactin

Adhäsions-G-Protein-gekoppelter Rezeptor L1

Synaptojanin 1

Erythrozytenmembranproteinband 4.1 wie 3

Calmodulin-Kinase-ähnliches Vesikel-assoziiertes Protein

Langzeitpotenzierung

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Diese Arbeit wurde vom National Key R&D Program of China [2020YFA0509300 an QL] unterstützt; National Natural Science Foundation of China gewährt [82125009, 31871082, 91849101 an QL, 92049202 an HX, 82071185 an JZ und 82071213 an YZ]; das Strategic Priority Research Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften [XDB39000000 bis QL]; Schlüsselforschungsprogramm für Grenzwissenschaften der Chinesischen Akademie der Wissenschaften [QYZDB-SSW-SMC035 bis QL]; CAS-Projekt für junge Wissenschaftler in der Grundlagenforschung [YSBR-013 bis QL]; und die Grundlagenforschungsfonds für die Zentraluniversitäten [zu QL].

Institut für Alterung und Hirnstörungen, das erste angegliederte Krankenhaus des USTC, Hefei National Laboratory for Physical Sciences at the Microscale, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, Hefei, 230026, China

Qingyang Zhang, Juan Zhang, Xiaohui Li, Hongda Liu, Xiaolin Ma und Qiang Liu

Schlüssellabor für biomedizinische Alterungsforschung der Provinz Anhui, Universität für Wissenschaft und Technologie von China, Hefei, 230026, China

Juan Zhang, Xiaohui Li und Qiang Liu

School of Life Sciences, Abteilung für Biowissenschaften und Medizin, Universität für Wissenschaft und Technologie von China, Hefei, 230026, China

Jin Ye & Chao Wang

Abteilung für Anästhesiologie, das erste angegliederte Krankenhaus des USTC, Abteilung für Biowissenschaften und Medizin, Universität für Wissenschaft und Technologie von China, Hefei, 230001, China

Keqiang He, Wei Zhang und Ji Yuan

Das erste angegliederte Krankenhaus der Universität Xiamen, Schlüssellabor der Provinz Fujian für neurodegenerative Erkrankungen und Altersforschung, Institut für Neurowissenschaften, Universität Xiamen, Xiamen, 361000, China

Yingjun Zhao & Huaxi Xu

Kompetenzzentrum für Tierentwicklung und Genetik, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Kunming, 650201, China

Qiang Liu

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QL betreute das Projekt. QZ, JZHX und QL konzipierten und gestalteten die Studie. QZ, J.Ye, XM, XL, HL, KH, WZ, J.Yuan. und CW führten Experimente durch und analysierten Daten. QZ, JZ, YZ, HX und QL diskutierten und verfassten das Manuskript. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Huaxi Xu oder Qiang Liu.

Unzutreffend.

Alle Autoren haben das endgültige Manuskript überprüft und stimmen der Veröffentlichung zu.

Die Autoren erklären, dass sie kein abschließendes Interesse haben.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhang, Q., Zhang, J., Ye, J. et al. Kernspeckle-spezifisches hnRNP D-like verhindert alters- und AD-bedingten kognitiven Rückgang durch Modulation des RNA-Spleißens. Mol Neurodegeneration 16, 66 (2021). https://doi.org/10.1186/s13024-021-00485-w

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Eingegangen: 05. Juli 2021

Angenommen: 12. August 2021

Veröffentlicht: 22. September 2021

DOI: https://doi.org/10.1186/s13024-021-00485-w

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